Page 103 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 103
strukture bioloških molekul
informacije o ozadju določitve 3D strukture tega proteina. Primarno zaporedje strukture
proteina, ki bo predstavljal predlogo za homologno modeliranje, nato poravnano s primarnim
zaporedjem tarčnega proteina. Včasih to poravnavo pred gradnjo 3D modela poiskušamo še
izboljšati, tudi z vključitvijo drugih modelov. Ko imamo predlogo in poravnani primarni
sekvenci, se lotimo izgradnje našega modela. Za to lahko uporabimo različna razvita
programska orodja, kot so Modeller, I-TASSER Swiss-Model, MOE, Phyre2 in Prime. Omenjeni
programi za gradnjo 3D modela uporabljajo različne pristope.
Ena možnost je fragmentno sestavljanje (ang. fragment assembly), kjer celoten model
sestavimo iz ohranjenih strukturnih fragmentov, ki jih identificiramo v sorodnih strukturah.
Najprej konstruiramo ohranjeno jedro nato pa dodamo še t. i. »spremenljive« regije, ponavadi
iz knjižnic takšnih fragmentov. Ujemanje segmentov (ang. segment matching) je drug možen
pristop, kjer protein razdelimo na niz kratkih segmentov, in 3D strukturo vsakega izmed njih
nato generiramo ločeno glede na najboljšo dostopno predlogo, ki jo identificiramo v PDB banki.
Tretja, najpogosteje uporabljena metoda, poskuša generirati 3D strukturo proteina tako, da le-
ta zadosti definiranim prostorskim omejitvam (ang. satisfaction of spatial restraints). Metoda
je dobila navdih po iz Poglavja III že poznanih geometrijskih omejitvah, ki jih pridobimo v NMR
eksperimentih. Le-te nato uporabimo za izračun in napoved 3D strukture. Najprej izvedemo
več 3D prileganj med tarčnim proteinom in predlogo in tako pridobimo več nizov geometrijskih
omejitev, kot so razdalje med ogrodnimi atomi, vrednosti torzijskih kotov itd. Te omejitve nato
uporabimo v globalnem optimizacijskem postopku, kjer s pomočjo energijske minimizacije oz.
geometrijske optimizacije ob upoštevanju teh omejitev iterativno najdemo najboljše pozicije
vseh atomov v tarčnem proteinu.
Posebno pozornost moramo posvetiti generiranju 3D strukture tistih delov tarčne proteinske
sekvence, ki niso poravnani z izbrano predlogo. Temu navadno pravimo modeliranje zank (ang.
loop modeling), saj le-teh pogosto ne najdemo v izhodni proteinski strukturi. Zaradi manjše
količine znanih podatkov uporabljenih pri napovedi 3D konformacij zank, je ta del končne 3D
strukture slabše napovedan. V splošnem velja, da so napovedi za zanke, ki vsebujejo do 8
aminokislin, praviloma zadovoljive. Pri tem koraku velikokrat uporabljamo tudi knjižnice že
znanih 3D struktur proteinskih zank, ali pa izvedemo lokalne geometrijske optimizacije z
različnimi nastavki strukture zanke.
Dobljena začetna 3D konformacija proteina ima pogosto visoko vrednost potencialne energije,
saj so določeni deli v konformacijsko in sterično neugodnih konformacijah. Zato dobljeni 3D
model optimiziramo tako, da izvedemo geometrijsko optimizacijo. Tako dobimo realnejšo in
stabilnejšo napovedano 3D konformacijo proteina.
Kot zadnji korak homolognega modeliranja izvedemo še validacijo dobljenega 3D modela.
Obstaja več pristopov in npr. lahko izvedemo statistično analizo, kjer pregledamo prisotnost in
frekvenco kontaktov med posameznimi aminokislinskimi preostanki v napovedani 3D strukturi,
v primerjavi z eksperimentalno rešenimi strukturami proteinov v proteinski bazi PDB. Razvili
so tudi več globalnih in lokalnih indeksov, ki glede na njigovo vrednost kvantitativno pokažejo,
kako dober je končni napovedan 3D model. Pri Vaji 4 boste pridobljeno znanje o homolognem
modeliranju preiskusili tudi v praksi, ko boste poskusili napovedati 3D strukturo neznanega
proteina.
103
informacije o ozadju določitve 3D strukture tega proteina. Primarno zaporedje strukture
proteina, ki bo predstavljal predlogo za homologno modeliranje, nato poravnano s primarnim
zaporedjem tarčnega proteina. Včasih to poravnavo pred gradnjo 3D modela poiskušamo še
izboljšati, tudi z vključitvijo drugih modelov. Ko imamo predlogo in poravnani primarni
sekvenci, se lotimo izgradnje našega modela. Za to lahko uporabimo različna razvita
programska orodja, kot so Modeller, I-TASSER Swiss-Model, MOE, Phyre2 in Prime. Omenjeni
programi za gradnjo 3D modela uporabljajo različne pristope.
Ena možnost je fragmentno sestavljanje (ang. fragment assembly), kjer celoten model
sestavimo iz ohranjenih strukturnih fragmentov, ki jih identificiramo v sorodnih strukturah.
Najprej konstruiramo ohranjeno jedro nato pa dodamo še t. i. »spremenljive« regije, ponavadi
iz knjižnic takšnih fragmentov. Ujemanje segmentov (ang. segment matching) je drug možen
pristop, kjer protein razdelimo na niz kratkih segmentov, in 3D strukturo vsakega izmed njih
nato generiramo ločeno glede na najboljšo dostopno predlogo, ki jo identificiramo v PDB banki.
Tretja, najpogosteje uporabljena metoda, poskuša generirati 3D strukturo proteina tako, da le-
ta zadosti definiranim prostorskim omejitvam (ang. satisfaction of spatial restraints). Metoda
je dobila navdih po iz Poglavja III že poznanih geometrijskih omejitvah, ki jih pridobimo v NMR
eksperimentih. Le-te nato uporabimo za izračun in napoved 3D strukture. Najprej izvedemo
več 3D prileganj med tarčnim proteinom in predlogo in tako pridobimo več nizov geometrijskih
omejitev, kot so razdalje med ogrodnimi atomi, vrednosti torzijskih kotov itd. Te omejitve nato
uporabimo v globalnem optimizacijskem postopku, kjer s pomočjo energijske minimizacije oz.
geometrijske optimizacije ob upoštevanju teh omejitev iterativno najdemo najboljše pozicije
vseh atomov v tarčnem proteinu.
Posebno pozornost moramo posvetiti generiranju 3D strukture tistih delov tarčne proteinske
sekvence, ki niso poravnani z izbrano predlogo. Temu navadno pravimo modeliranje zank (ang.
loop modeling), saj le-teh pogosto ne najdemo v izhodni proteinski strukturi. Zaradi manjše
količine znanih podatkov uporabljenih pri napovedi 3D konformacij zank, je ta del končne 3D
strukture slabše napovedan. V splošnem velja, da so napovedi za zanke, ki vsebujejo do 8
aminokislin, praviloma zadovoljive. Pri tem koraku velikokrat uporabljamo tudi knjižnice že
znanih 3D struktur proteinskih zank, ali pa izvedemo lokalne geometrijske optimizacije z
različnimi nastavki strukture zanke.
Dobljena začetna 3D konformacija proteina ima pogosto visoko vrednost potencialne energije,
saj so določeni deli v konformacijsko in sterično neugodnih konformacijah. Zato dobljeni 3D
model optimiziramo tako, da izvedemo geometrijsko optimizacijo. Tako dobimo realnejšo in
stabilnejšo napovedano 3D konformacijo proteina.
Kot zadnji korak homolognega modeliranja izvedemo še validacijo dobljenega 3D modela.
Obstaja več pristopov in npr. lahko izvedemo statistično analizo, kjer pregledamo prisotnost in
frekvenco kontaktov med posameznimi aminokislinskimi preostanki v napovedani 3D strukturi,
v primerjavi z eksperimentalno rešenimi strukturami proteinov v proteinski bazi PDB. Razvili
so tudi več globalnih in lokalnih indeksov, ki glede na njigovo vrednost kvantitativno pokažejo,
kako dober je končni napovedan 3D model. Pri Vaji 4 boste pridobljeno znanje o homolognem
modeliranju preiskusili tudi v praksi, ko boste poskusili napovedati 3D strukturo neznanega
proteina.
103
