Page 44 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 44
andrej perdih, katja lakota, alja prah
1. ZGODOVINA IN VLOGA KRISTALOGRAFIJE
Kristalografija je metoda, ki omogoča določitev tridimenzionalne (3D) razporeditve atomov
znotraj kristala, ki ga obsevamo z x-žarki. Le-ti se ob interakciji s kristalom razpršijo v specifične
smeri, odvisne od strukture kristala in molekule, ki jo vsebuje. S poznavanjem kotov sipanih
žarkov ter njihovih faz lahko kristalograf določi tridimenzionalno sliko na osnovi poznane
elektronske gostote proteina v kristalu. Metodo so najprej uporabljali za reševanje struktur
organskih in anorganskih molekul z manjšo molekulsko maso, kasneje pa se je pričela
uporabljati tudi za določevanje struktur bioloških molekul (proteinov, RNA, DNA). V tem
poglavju se bomo osredotočili na uporabo te metode za določevanje 3D strukture proteinov –
proteinsko kristalografijo.
Čeprav so raziskovalci študirali kristalizacijo proteinov že v drugi polovici 19. stoletja, za enega
izmed pomembnih korakov začetka razvoja metode lahko štejemo leto 1934, ko sta John. D.
Bernal in Dorothy Crawfoot prva izmerila difrakcijo kristalov pepsina v raztopini, ki sta jih
obsevala z rentgenskimi x-žarki. Prve kristalne strukture proteinov so rešili v poznih petdesetih
letih prejšnjega stoletja. Prva struktura proteina mioglobina je bila objavljena leta 1958. Za to
odkritje in vpeljavo metode sta leta 1962 John Cowdery Kendrew in Max Perutz dobila
Nobelovo nagrado za kemijo. Od takrat so raziskovalci določili že več kot 150.000 kristalnih
struktur proteinov, nukleinskih kislin, pa tudi virusov in drugih zanimivih bioloških molekul, ki
so dostopne v proteinski banki struktur PDB. Druga metoda, NMR spektroskopija, ki jo bomo
spoznali v Poglavju III, je po obsegu določila le kakšnih 10 % toliko struktur bioloških molekul
kot kristalografija.
Pomembna prednost kristalografije je, da lahko določi strukturo praktično poljubno velike
biološke molekule, medtem ko je NMR spektroskopija omejena na nekoliko manjše biološke
sisteme velikosti nekje do 70 kDa. Rentgenska kristalografija se tako danes rutinsko uporablja v
raziskavah struktur bioloških molekul. Poleg velike količine pridobljenega bazičnega znanja o
strukturnih lastnostih bioloških molekul rentgenska kristalografija omogoča vpogled tudi v
vezavo ligandov (npr. fizioloških ligandov, zdravilnih učinkovin), na njihove tarče (npr.
receptorje, encime, ionske kanale, itd.). Ti podatki omogočajo strukturno podprto načrtovanje
novih zdravilnih učinkovin in več o uporabi proteinskih struktur v ta namen bomo spoznali v
Poglavju VI.
Kljub obsežnemu napredku tehnologije, povezane s to metodo, nekatere biološke
markomolekule, predvsem membranski proteini, ostajajo velik izziv za kristalizacijo. Le-ti
namreč potrebujejo specifične detergente ter druga stredstva za ustrezno solubilizacijo
proteina, taki detergenti pa pogosto motijo proces kristalizacije. Membranski proteini pa
predstavljajo pomembne skupine proteinov v telesu, kot so na primer ionski kanali in različni
receptorji za nevrotransmiterje. V zadnjih letih pridobiva na pomenu tudi krioelektronska
mikroskopija, ki tudi omogoča določitev 3D struktur velikih bioloških makromolekul, tudi
proteinskih kompleksov.
44
1. ZGODOVINA IN VLOGA KRISTALOGRAFIJE
Kristalografija je metoda, ki omogoča določitev tridimenzionalne (3D) razporeditve atomov
znotraj kristala, ki ga obsevamo z x-žarki. Le-ti se ob interakciji s kristalom razpršijo v specifične
smeri, odvisne od strukture kristala in molekule, ki jo vsebuje. S poznavanjem kotov sipanih
žarkov ter njihovih faz lahko kristalograf določi tridimenzionalno sliko na osnovi poznane
elektronske gostote proteina v kristalu. Metodo so najprej uporabljali za reševanje struktur
organskih in anorganskih molekul z manjšo molekulsko maso, kasneje pa se je pričela
uporabljati tudi za določevanje struktur bioloških molekul (proteinov, RNA, DNA). V tem
poglavju se bomo osredotočili na uporabo te metode za določevanje 3D strukture proteinov –
proteinsko kristalografijo.
Čeprav so raziskovalci študirali kristalizacijo proteinov že v drugi polovici 19. stoletja, za enega
izmed pomembnih korakov začetka razvoja metode lahko štejemo leto 1934, ko sta John. D.
Bernal in Dorothy Crawfoot prva izmerila difrakcijo kristalov pepsina v raztopini, ki sta jih
obsevala z rentgenskimi x-žarki. Prve kristalne strukture proteinov so rešili v poznih petdesetih
letih prejšnjega stoletja. Prva struktura proteina mioglobina je bila objavljena leta 1958. Za to
odkritje in vpeljavo metode sta leta 1962 John Cowdery Kendrew in Max Perutz dobila
Nobelovo nagrado za kemijo. Od takrat so raziskovalci določili že več kot 150.000 kristalnih
struktur proteinov, nukleinskih kislin, pa tudi virusov in drugih zanimivih bioloških molekul, ki
so dostopne v proteinski banki struktur PDB. Druga metoda, NMR spektroskopija, ki jo bomo
spoznali v Poglavju III, je po obsegu določila le kakšnih 10 % toliko struktur bioloških molekul
kot kristalografija.
Pomembna prednost kristalografije je, da lahko določi strukturo praktično poljubno velike
biološke molekule, medtem ko je NMR spektroskopija omejena na nekoliko manjše biološke
sisteme velikosti nekje do 70 kDa. Rentgenska kristalografija se tako danes rutinsko uporablja v
raziskavah struktur bioloških molekul. Poleg velike količine pridobljenega bazičnega znanja o
strukturnih lastnostih bioloških molekul rentgenska kristalografija omogoča vpogled tudi v
vezavo ligandov (npr. fizioloških ligandov, zdravilnih učinkovin), na njihove tarče (npr.
receptorje, encime, ionske kanale, itd.). Ti podatki omogočajo strukturno podprto načrtovanje
novih zdravilnih učinkovin in več o uporabi proteinskih struktur v ta namen bomo spoznali v
Poglavju VI.
Kljub obsežnemu napredku tehnologije, povezane s to metodo, nekatere biološke
markomolekule, predvsem membranski proteini, ostajajo velik izziv za kristalizacijo. Le-ti
namreč potrebujejo specifične detergente ter druga stredstva za ustrezno solubilizacijo
proteina, taki detergenti pa pogosto motijo proces kristalizacije. Membranski proteini pa
predstavljajo pomembne skupine proteinov v telesu, kot so na primer ionski kanali in različni
receptorji za nevrotransmiterje. V zadnjih letih pridobiva na pomenu tudi krioelektronska
mikroskopija, ki tudi omogoča določitev 3D struktur velikih bioloških makromolekul, tudi
proteinskih kompleksov.
44
