Page 47 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 47
strukture bioloških molekul
veliko napora in izkušenj, včasih pa tudi malo sreče z izborom pogojev. Različne korake
kristalizacije, glede na količino obarjalnih spojin/precipitanov - snovi, ki omogočajo kristalizacijo
proteina - si lahko ogledamo na diagramu Slike 2B.
Kristalizacijo pričnemo z očiščenim proteinom, ki ga predhodno še skoncentriramo. Osnovna
ideja tega koraka je, da vzorec proteina v kristalizacijskih pogojih najprej privedemo do
supernasičenja raztopine z dodatkom precipitantov. To nato vodi do nastanka kristalizacijskih
jeder proteina in nadaljnje spontane nukleacije in rasti proteinskega kristala (Slika 2B).
Supernasičenje dosežemo z variiranjem: temperature, pH, koncentracije precipitantov (npr. soli,
kot so: amonijev sulfat, amonijev fosfat, natrijev citrat, itd.) ter organskih topil (npr. etanol,
propanol, izopropanol, itd.).
Za kristalizacijo proteinov pogosto uporabljamo metodo viseče kapljice (ang. hanging drop
method). Aparatura za to metodo je prikazana na spodnjem delu Slike 2B. Pufer za kristalizacijo
predstavlja matično raztopino (V = 0.5 - 1 mL). Na ravno stekleno površino damo kapljico, ki
vsebuje ½ raztopine proteina in ½ pufra za kristalizacijo (V = 6-10 mL). To pomeni, da je
koncentracija precipitantov v kapljici ½ koncentracije le-teh v matični raztopini pufra. Kapljico
obrnemo v raztopino in sistem neprodušno zapremo. Koncentracija precipitanta oz.
precipitantov v kapljici se bo počasi ekvilibrirala s koncetracijo v matični raztopini preko difuzije
vodne pare. Tako bo lahko prišlo najprej do supernasičenja raztopine, nato do nukleacije ter na
koncu do tvorbe proteinskega kristala.
Ravno določitev optimalnih pogojev, kjer bo kritalizacija uspešna, je tisti korak, ki ga zelo težko
napovemo v naprej. Pogosto je potrebno izvesti veliko eksperimentov pri različnih pogojih in
imeti tudi malo sreče, da na koncu dobimo proteinski kristal. Zato danes pri tem koraku
kristalografije pogosto uporabljamo robotske sisteme, ki lahko v kratkem času preučijo veliko
različnih kristalizacijskih pogojev.
4. DIFRAKCIJSKI EKSPERIMENT
Zakaj pri kristalografiji sploh uporabljamo rentgenske žarke? V vseh vrstah mikroskopije je
količina informacij, ki jih lahko dobimo, omejena z valovno dolžino uporabljenega
elektromagnetnega (EM) valovanja. Pri običajni mikroskopiji, kjer uporabljamo vidno svetlobo
(VIS), je najkrajša valovna dolžina okoli 350 nm in to definira tudi najmanjše strukture, ki jih
lahko določimo. To omogoča, da na primer lahko z mikroskopom opazujemo organele v celici.
Da lahko določimo strukturo proteina z atomistično natančnostjo, potrebujemo
elektromagnetno valovanje z valovno dolžino na nivoju velikosti atomov, to je okoli 0.1 nm. V
to območje elektromagnetnega valovanja se uvrščajo x-žarki z valovnimi dolžinami med 0.01
do 10 nm.
Najpogosteje uporabljamo dva izvora rentgenske svetlobe:
1. Anode. Začetne difrakcijske eksperimente s proteinskimi kristali lahko izvedemo s tem
lokalnim virom rentgenskega EM valovanja. Anodni izvori rentgenskih žarkov so
(relativno) poceni in enostavni za vzdrževanje ter omogočajo hiter potek difrakcijskih
eksperimentov. Ena glavnih omejitev je ozek obseg valovnih dolžin, ki jih lahko
47
veliko napora in izkušenj, včasih pa tudi malo sreče z izborom pogojev. Različne korake
kristalizacije, glede na količino obarjalnih spojin/precipitanov - snovi, ki omogočajo kristalizacijo
proteina - si lahko ogledamo na diagramu Slike 2B.
Kristalizacijo pričnemo z očiščenim proteinom, ki ga predhodno še skoncentriramo. Osnovna
ideja tega koraka je, da vzorec proteina v kristalizacijskih pogojih najprej privedemo do
supernasičenja raztopine z dodatkom precipitantov. To nato vodi do nastanka kristalizacijskih
jeder proteina in nadaljnje spontane nukleacije in rasti proteinskega kristala (Slika 2B).
Supernasičenje dosežemo z variiranjem: temperature, pH, koncentracije precipitantov (npr. soli,
kot so: amonijev sulfat, amonijev fosfat, natrijev citrat, itd.) ter organskih topil (npr. etanol,
propanol, izopropanol, itd.).
Za kristalizacijo proteinov pogosto uporabljamo metodo viseče kapljice (ang. hanging drop
method). Aparatura za to metodo je prikazana na spodnjem delu Slike 2B. Pufer za kristalizacijo
predstavlja matično raztopino (V = 0.5 - 1 mL). Na ravno stekleno površino damo kapljico, ki
vsebuje ½ raztopine proteina in ½ pufra za kristalizacijo (V = 6-10 mL). To pomeni, da je
koncentracija precipitantov v kapljici ½ koncentracije le-teh v matični raztopini pufra. Kapljico
obrnemo v raztopino in sistem neprodušno zapremo. Koncentracija precipitanta oz.
precipitantov v kapljici se bo počasi ekvilibrirala s koncetracijo v matični raztopini preko difuzije
vodne pare. Tako bo lahko prišlo najprej do supernasičenja raztopine, nato do nukleacije ter na
koncu do tvorbe proteinskega kristala.
Ravno določitev optimalnih pogojev, kjer bo kritalizacija uspešna, je tisti korak, ki ga zelo težko
napovemo v naprej. Pogosto je potrebno izvesti veliko eksperimentov pri različnih pogojih in
imeti tudi malo sreče, da na koncu dobimo proteinski kristal. Zato danes pri tem koraku
kristalografije pogosto uporabljamo robotske sisteme, ki lahko v kratkem času preučijo veliko
različnih kristalizacijskih pogojev.
4. DIFRAKCIJSKI EKSPERIMENT
Zakaj pri kristalografiji sploh uporabljamo rentgenske žarke? V vseh vrstah mikroskopije je
količina informacij, ki jih lahko dobimo, omejena z valovno dolžino uporabljenega
elektromagnetnega (EM) valovanja. Pri običajni mikroskopiji, kjer uporabljamo vidno svetlobo
(VIS), je najkrajša valovna dolžina okoli 350 nm in to definira tudi najmanjše strukture, ki jih
lahko določimo. To omogoča, da na primer lahko z mikroskopom opazujemo organele v celici.
Da lahko določimo strukturo proteina z atomistično natančnostjo, potrebujemo
elektromagnetno valovanje z valovno dolžino na nivoju velikosti atomov, to je okoli 0.1 nm. V
to območje elektromagnetnega valovanja se uvrščajo x-žarki z valovnimi dolžinami med 0.01
do 10 nm.
Najpogosteje uporabljamo dva izvora rentgenske svetlobe:
1. Anode. Začetne difrakcijske eksperimente s proteinskimi kristali lahko izvedemo s tem
lokalnim virom rentgenskega EM valovanja. Anodni izvori rentgenskih žarkov so
(relativno) poceni in enostavni za vzdrževanje ter omogočajo hiter potek difrakcijskih
eksperimentov. Ena glavnih omejitev je ozek obseg valovnih dolžin, ki jih lahko
47
