Page 45 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 45
strukture bioloških molekul
2. EKSPERIMENT PROTEINSKE KRITALOGRAFIJE
Najprej na kratko opišimo metodo proteinske kristalografije, ki je predstavljena na sliki 1. Nato
bomo v nadaljevanju natančneje obravnavali njene posamezne korake. Podobno bi pristopali
tudi v primeru, če bi določevali 3D strukturo drugih makromolekul (npr. nukleinskih kislin). Delo
pričnemo tako, da najprej pridobimo, izoliramo in očistimo protein, katerega 3D strukturo
želimo določiti. Nato očiščen protein raztopimo in kristaliziramo z uporabo različnih
kristalizacijskih sredstev (A). Kristalizacija proteina predstavlja tudi najbolj nepredvidljiv korak
metode (B). Nato kristale proteina obsevamo z rentgenskimi žarki, kar povzroči, da se vpadni
x-žarki sipajo na elektronih, ki sestavljajo biološko makromolekulo (C). Dobimo difrakcijsko sliko
proteina (D). Z merjenjem kotov in intenzitet teh razpršenih rentgenskih žarkov lahko
pridobimo tridimenzionalno sliko gostote elektronov znotraj kristala. Še pred tem moramo
rešiti t. i. fazni problem in določiti faze sipanih žarkov v difrakcijski sliki. Zato imamo na voljo več
metod, ki jih bomo še spoznali. Pretvorba difrakcijske slike v elektronsko gostoto je možna, zato
ker sta prostora odbojev in elektronske gostote povezana s Fourierjevo transformacijo. V
dobljeno elektronsko gostoto, ob poznavanju primarne strukture proteina, umestimo njegov
3D model tako, da kar najbolje upošteva eksperimentalne omejitve dobljene elektronske
gostote. Tako najprej pridobimo začetni 3D model proteina, ki ga nato v več iteracijah
optimizacije izboljšamo (E). Na koncu ocenimo kvaliteto končnega 3D modela z več
kvalitativnimi in kvantitativnimi kriteriji, ki nam povedo, kako dober model proteina smo dobili.
Slika 1. Shematski prikaz metode proteinske kristalografije.
3. PRIPRAVA IN KRISTALIZACIJA PROTEINA
Za pričetek proteinske kristalografije potrebujemo raztopino očiščenega proteina v praviloma
nativnem fiziološkem stanju. Protein lahko pridobimo na dva načina. Lahko ga izoliramo iz
izvornega vira, kar pa pogosto ne omogoča pridobitve zadostne količine proteina. Največkrat
gen za protein vstavimo v primeren ekpresijski sistem (npr. bakterije ali glive), da tako dobimo
45
2. EKSPERIMENT PROTEINSKE KRITALOGRAFIJE
Najprej na kratko opišimo metodo proteinske kristalografije, ki je predstavljena na sliki 1. Nato
bomo v nadaljevanju natančneje obravnavali njene posamezne korake. Podobno bi pristopali
tudi v primeru, če bi določevali 3D strukturo drugih makromolekul (npr. nukleinskih kislin). Delo
pričnemo tako, da najprej pridobimo, izoliramo in očistimo protein, katerega 3D strukturo
želimo določiti. Nato očiščen protein raztopimo in kristaliziramo z uporabo različnih
kristalizacijskih sredstev (A). Kristalizacija proteina predstavlja tudi najbolj nepredvidljiv korak
metode (B). Nato kristale proteina obsevamo z rentgenskimi žarki, kar povzroči, da se vpadni
x-žarki sipajo na elektronih, ki sestavljajo biološko makromolekulo (C). Dobimo difrakcijsko sliko
proteina (D). Z merjenjem kotov in intenzitet teh razpršenih rentgenskih žarkov lahko
pridobimo tridimenzionalno sliko gostote elektronov znotraj kristala. Še pred tem moramo
rešiti t. i. fazni problem in določiti faze sipanih žarkov v difrakcijski sliki. Zato imamo na voljo več
metod, ki jih bomo še spoznali. Pretvorba difrakcijske slike v elektronsko gostoto je možna, zato
ker sta prostora odbojev in elektronske gostote povezana s Fourierjevo transformacijo. V
dobljeno elektronsko gostoto, ob poznavanju primarne strukture proteina, umestimo njegov
3D model tako, da kar najbolje upošteva eksperimentalne omejitve dobljene elektronske
gostote. Tako najprej pridobimo začetni 3D model proteina, ki ga nato v več iteracijah
optimizacije izboljšamo (E). Na koncu ocenimo kvaliteto končnega 3D modela z več
kvalitativnimi in kvantitativnimi kriteriji, ki nam povedo, kako dober model proteina smo dobili.
Slika 1. Shematski prikaz metode proteinske kristalografije.
3. PRIPRAVA IN KRISTALIZACIJA PROTEINA
Za pričetek proteinske kristalografije potrebujemo raztopino očiščenega proteina v praviloma
nativnem fiziološkem stanju. Protein lahko pridobimo na dva načina. Lahko ga izoliramo iz
izvornega vira, kar pa pogosto ne omogoča pridobitve zadostne količine proteina. Največkrat
gen za protein vstavimo v primeren ekpresijski sistem (npr. bakterije ali glive), da tako dobimo
45
