Page 59 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 59
strukture bioloških molekul
pulzom radiofrekvenčnega (RF) valovanja vzbudimo jedra v vzorcu, da le-ta preidejo iz
osnovnega stanja v vzbujena stanja, npr. iz energijsko ugodnejšega stanja α v energijsko višje
stanje β, kot to prikazuje Slika 2. To se zgodi, ko je zunanja frekvenca RF valovanja enaka lastni
frekvenci magnetno aktivnega jedra. Jedra lahko vzbujamo pod določenim kotom glede na
magnetno polje spektrometra in obseg vzbujanja lahko nadzorujemo tudi s časom trajanja
pulza (cca med 3-8 µs).
Po določenem času se vzbujena jedra vrnejo v osnovno stanje, kar imenujemo relaksacija, in
ob tem izsevajo elektromagnetno valovanje določenih frekvenc. Temu pravimo tudi »prosti
indukcijski razpad« (ang. free induction decay FID). Relaksacijski čas je odvisen od vsakega
magnetno aktivnega jedra. Gre pa vedno za zelo šibek signal, zato za njegovo detekcijo
potrebujemo občutljive detekorje (t. i. sprejemna tuljava). Navadno vsak NMR eksperiment za
ojačitev signala in lažjo detekcijo večkrat ponovimo (npr. pri 1H NMR eksperimentih naredimo
cca. 16 ponovitev). Pri atomskih jedrih, ki niso vodik, je relaksacijski čas precej dolg (cca. 8
sekund za atom 13C), zato je pridobivanje NMR spektrov za ta jedra precej zamudno in lahko
traja tudi več ur, saj eksperiment lahko ponovimo le po koncu relaksacije jedra.
Zaznani signal relaksacije vsebuje vse frekvence, ki jih oddajajo magnetno aktivna jedra v
preiskovani molekuli. Dobljene signale vseh jeder zapišemo in obdelamo s Fourierovo
transformacijo. Zapis nihanja prestavimo iz časovne domene v frekvenčno. Tako iz zapisa vseh
nihanj magnetno aktivnih jeder po času dobimo zapis nihanj magnetno aktivnih jeder pri
posameznih frekvencah - to je 1D NMR spekter (Slika 2).
Slika 2. Poenostavljena shema enodimenzionalnega 1H NMR eskperimenta.
Pri NMR eksperimentih ne moremo uporabljati večine standardnih topil, kot so voda, aceton,
tehtrahidrofuran in podobna, saj vsebujejo magnetno aktivna jedra. Ta bi predstavljala
praktično vse molekule, ki sestavljajo raztopino in tako tvorila večino dobljenega signala. Da se
izognemo zaznavanju samo teh signalov, uporabljamo magnetno neaktivna devterirana topila,
pri katerih je več kot 99 % vodikovih atomov zamenjanih z devterijem D. Najpogosteje
uporabljeno devterirano topilo pri NMR eksperimentih je devteriran kloroform (CDCl3).
59
pulzom radiofrekvenčnega (RF) valovanja vzbudimo jedra v vzorcu, da le-ta preidejo iz
osnovnega stanja v vzbujena stanja, npr. iz energijsko ugodnejšega stanja α v energijsko višje
stanje β, kot to prikazuje Slika 2. To se zgodi, ko je zunanja frekvenca RF valovanja enaka lastni
frekvenci magnetno aktivnega jedra. Jedra lahko vzbujamo pod določenim kotom glede na
magnetno polje spektrometra in obseg vzbujanja lahko nadzorujemo tudi s časom trajanja
pulza (cca med 3-8 µs).
Po določenem času se vzbujena jedra vrnejo v osnovno stanje, kar imenujemo relaksacija, in
ob tem izsevajo elektromagnetno valovanje določenih frekvenc. Temu pravimo tudi »prosti
indukcijski razpad« (ang. free induction decay FID). Relaksacijski čas je odvisen od vsakega
magnetno aktivnega jedra. Gre pa vedno za zelo šibek signal, zato za njegovo detekcijo
potrebujemo občutljive detekorje (t. i. sprejemna tuljava). Navadno vsak NMR eksperiment za
ojačitev signala in lažjo detekcijo večkrat ponovimo (npr. pri 1H NMR eksperimentih naredimo
cca. 16 ponovitev). Pri atomskih jedrih, ki niso vodik, je relaksacijski čas precej dolg (cca. 8
sekund za atom 13C), zato je pridobivanje NMR spektrov za ta jedra precej zamudno in lahko
traja tudi več ur, saj eksperiment lahko ponovimo le po koncu relaksacije jedra.
Zaznani signal relaksacije vsebuje vse frekvence, ki jih oddajajo magnetno aktivna jedra v
preiskovani molekuli. Dobljene signale vseh jeder zapišemo in obdelamo s Fourierovo
transformacijo. Zapis nihanja prestavimo iz časovne domene v frekvenčno. Tako iz zapisa vseh
nihanj magnetno aktivnih jeder po času dobimo zapis nihanj magnetno aktivnih jeder pri
posameznih frekvencah - to je 1D NMR spekter (Slika 2).
Slika 2. Poenostavljena shema enodimenzionalnega 1H NMR eskperimenta.
Pri NMR eksperimentih ne moremo uporabljati večine standardnih topil, kot so voda, aceton,
tehtrahidrofuran in podobna, saj vsebujejo magnetno aktivna jedra. Ta bi predstavljala
praktično vse molekule, ki sestavljajo raztopino in tako tvorila večino dobljenega signala. Da se
izognemo zaznavanju samo teh signalov, uporabljamo magnetno neaktivna devterirana topila,
pri katerih je več kot 99 % vodikovih atomov zamenjanih z devterijem D. Najpogosteje
uporabljeno devterirano topilo pri NMR eksperimentih je devteriran kloroform (CDCl3).
59
