Page 54 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 54
andrej perdih, katja lakota, alja prah
dobljenih eksperimentalnih odbojev in določenih faz. Seveda dobra resolucija omogoča lažjo
in natančnejšo gradnjo 3D molekulskega modela proteina. Navadno velja, da resolucija nižja
od 3.0 Å že omogoča sprejemljivo postavitev 3D modela in zadovoljivo interpretacijo
elektronske gostote. Pri resoluciji pod 2.0 Å gradnja 3D modela s pomočjo različnih
računalniških programov poteka že skoraj popolnoma avtomatizirano. Če je dobljena resolucija
nižja od 1.2 Å, pa včasih lahko celo določimo pozicije nekaterih vodikovih atomov v proteinu,
ki jih z rentgensko difrakcijo večinoma sploh ne moremo določiti. Za boljšo predstavo razliko
med resolucijo 3.0 Å in 1.2 Å na primeru stranske verige aminokisline tirozina prikazujemo na
srednjem delu Slike 6.
Ko pridobimo začetni 3D model, ga potem v več stopnjah poskušamo optimizirati in izboljšati
(ang. model refinement), da dobimo kar najboljše možno ujemenje z eksperimentalno
elektronsko gostoto. Na osnovi izračunanih koordinat atomov v začetnem modelu in vrednosti
njihovih B-faktorjev (Debye-Wallerjev faktor), ki predstavljajo, kot bomo to videli še v
nadaljevanju, toplotno gibanje atoma, poskušamo njihove koordinate atomov v modelu
spremeniti tako, da bolj ustrezajo opazovanim difrakcijskim podatkom, kar lahko rezultira v
optimalnejših fazah, kot so tiste, ki smo jih uporabili na začetku. Nato izračunano elektronsko
gostoto z novimi fazami prilegamo novemu modelu in ta iterativni postopek nadaljujemo,
dokler ne dobimo najboljše možne korelacije med difrakcijskimi podatki in 3D modelom
proteina (Slika 5).
Ustreznost ujemanja lahko ovrednotimo z R faktorjem, ki primerja eksperimentalno
elektronsko gostoto in 3D kristalografski model, preko izračunanih Fcalc in eksperimentalno
dobljenih Fcobs strukturnih faktorjev F. Uporabimo spodnjo enačbo:
= ∑ ||456| − |78-7||
∑ |456|
Vrednosti R faktorja in interpretacija so naslednji:
0.6 Zelo slabo ujemanje
0.5 Slabo ujemanje
0.4 Spodnja meja sprejemljivosti ujemanja
0.2 Dobro za proteinske molekule
0.05 Dobro za majhne organske molekule
0 Popolno ujemanje
Kot merilo za kakovost modela se je v zadnjih letih uveljavil prosti R faktor (Rfree). Pri tej metodi
določen delež odbojev (5–10 %), ki jih damo v testni niz, ločimo od preostalih odbojev. 3D
model proteina zgradimo z upoštevanjem slednjih in na koncu izračunamo še ujemanje modela
s testnim setom ter določimo Rfree faktor.
Kvaliteto dobljenega 3D proteinskega modela potem validiramo še z drugimi geometrijskimi
kriteriji. Preverimo, ali so dolžine vezi, valenčni koti in ravnine v skladu z dovoljenimi vrednostmi
za molekulske strukture, ki sestavljajo proteine. Prav tako pogledamo, ali imajo aminokisline
ustrezno okolico. Za veliko proteinov je na primer značilno, da imajo hidrofobno sredico in
polarno površino. Dovoljene konformacije stranskih verig so navadno tudi omejene in obstajajo
knjižnice možnih rotamerov, s katerimi lahko preverimo skladnost dobljene strukture.
54
dobljenih eksperimentalnih odbojev in določenih faz. Seveda dobra resolucija omogoča lažjo
in natančnejšo gradnjo 3D molekulskega modela proteina. Navadno velja, da resolucija nižja
od 3.0 Å že omogoča sprejemljivo postavitev 3D modela in zadovoljivo interpretacijo
elektronske gostote. Pri resoluciji pod 2.0 Å gradnja 3D modela s pomočjo različnih
računalniških programov poteka že skoraj popolnoma avtomatizirano. Če je dobljena resolucija
nižja od 1.2 Å, pa včasih lahko celo določimo pozicije nekaterih vodikovih atomov v proteinu,
ki jih z rentgensko difrakcijo večinoma sploh ne moremo določiti. Za boljšo predstavo razliko
med resolucijo 3.0 Å in 1.2 Å na primeru stranske verige aminokisline tirozina prikazujemo na
srednjem delu Slike 6.
Ko pridobimo začetni 3D model, ga potem v več stopnjah poskušamo optimizirati in izboljšati
(ang. model refinement), da dobimo kar najboljše možno ujemenje z eksperimentalno
elektronsko gostoto. Na osnovi izračunanih koordinat atomov v začetnem modelu in vrednosti
njihovih B-faktorjev (Debye-Wallerjev faktor), ki predstavljajo, kot bomo to videli še v
nadaljevanju, toplotno gibanje atoma, poskušamo njihove koordinate atomov v modelu
spremeniti tako, da bolj ustrezajo opazovanim difrakcijskim podatkom, kar lahko rezultira v
optimalnejših fazah, kot so tiste, ki smo jih uporabili na začetku. Nato izračunano elektronsko
gostoto z novimi fazami prilegamo novemu modelu in ta iterativni postopek nadaljujemo,
dokler ne dobimo najboljše možne korelacije med difrakcijskimi podatki in 3D modelom
proteina (Slika 5).
Ustreznost ujemanja lahko ovrednotimo z R faktorjem, ki primerja eksperimentalno
elektronsko gostoto in 3D kristalografski model, preko izračunanih Fcalc in eksperimentalno
dobljenih Fcobs strukturnih faktorjev F. Uporabimo spodnjo enačbo:
= ∑ ||456| − |78-7||
∑ |456|
Vrednosti R faktorja in interpretacija so naslednji:
0.6 Zelo slabo ujemanje
0.5 Slabo ujemanje
0.4 Spodnja meja sprejemljivosti ujemanja
0.2 Dobro za proteinske molekule
0.05 Dobro za majhne organske molekule
0 Popolno ujemanje
Kot merilo za kakovost modela se je v zadnjih letih uveljavil prosti R faktor (Rfree). Pri tej metodi
določen delež odbojev (5–10 %), ki jih damo v testni niz, ločimo od preostalih odbojev. 3D
model proteina zgradimo z upoštevanjem slednjih in na koncu izračunamo še ujemanje modela
s testnim setom ter določimo Rfree faktor.
Kvaliteto dobljenega 3D proteinskega modela potem validiramo še z drugimi geometrijskimi
kriteriji. Preverimo, ali so dolžine vezi, valenčni koti in ravnine v skladu z dovoljenimi vrednostmi
za molekulske strukture, ki sestavljajo proteine. Prav tako pogledamo, ali imajo aminokisline
ustrezno okolico. Za veliko proteinov je na primer značilno, da imajo hidrofobno sredico in
polarno površino. Dovoljene konformacije stranskih verig so navadno tudi omejene in obstajajo
knjižnice možnih rotamerov, s katerimi lahko preverimo skladnost dobljene strukture.
54
