Page 52 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 52
andrej perdih, katja lakota, alja prah
METODA 1: MULTIPLA IZOMORFNA ZAMENJAVA
(ang. Mutiple Isomorphous Replacement - MIR)
MIR je najstarejša metoda reševanja faznega problema v kristalografiji in z njo so leta 1958 rešili
prvo kristalno strukturo mioglobina. Pri MIR z uvedbo „težkega atoma“ v proteinski kristal
spremenimo dobljeno difrakcijsko sliko. V ta namen uporabimo atome kot so: Pt, Pb, Hg. S
primerjavo dobljenih difrakacijskih slik proteinskih kristalov z vsebovanimi težkimi atomi in pa
brez njih, je mogoče določiti položaj (koordinate) težkih atomov ter tudi njihove faze. Nato
ocenimo vpliv uvedenega atoma na intenzitete preostalih difrakcijskih žarkov, ki izhajajo iz
proteinskih atomov, kar nam pomaga pri določitvi njihovih faz. Ponavadi pri tem pristopu
uporabljamo vsaj dva različna težka atoma (dva ločena eksperimenta), ki ju kristaliziramo skupaj
s proteinom. Metoda MIR tudi predpostavlja, da se dimenzija enotne celice ohranja pri vseh
eksperimentih in da imajo proteinski kristali definirano mesto vezave. Pri tej metodi pogosto
naletimo na težave, saj se proteinski kristali v prisotnosti težkih atomov ne tvorijo.
METODA 2: MULTIPLA ANOMALNA DISPERZIJA
(ang. Mutiple Anomalous Dispersion - MAD)
MAD je zelo podobna tehnika kot je MIR, le da tu uporabimo dejstvo, da atomi težkih atomov
pri določenih valovnih dolžinah anomalično razpršijo x-žarke s spremembo amplitude in faze.
Pri tej metodi lahko poleg prej omenjenih težkih atomov v strukturo proteina vključimo tudi
aminokislino selenometionin, ki namesto žvepla vsebuje z elektroni bogatejši atom selena. Za
uporabo MAD metode moramo zato biti sposobni proizvesti x-žarke z različnimi valovnimi
dolžinami, kar nam omogoča sinhrotron. Z merjenjem difrakcij pri teh izbranih valovnih dolžinah
lažje najdemo lokacijo in fazo težkega atoma oz. selenometionina. Analogno kot pri MIR metodi
se ti podatki nato uporabijo za določitev faz preostalih difraktiranih žarkov.
METODA 3: MOLEKULSKA ZAMENJAVA
(ang. Molecular Replacement - MR)
MR je najpogosteje uporabljena tehnika proteinske kristalografije, saj pogosto obstaja že
rešena 3D struktura homolognega proteina. Tako lahko kot začetne faze pri izračunu
elektronske gostote privzamemo kar te, ki so bile dobljene pri homologni strukturi, in jih
kombiniramo z dobljenimi intenzitetami odbojev. Metoda molekulske izmenjave je uporabna
le, če želimo določiti strukturo proteinu, ki je po primarni sekvenci vsaj v 25 % podoben
proteinu, za katerega 3D struktura že obstaja. Preden pričnemo z izračunom elektronske
gostote, moramo s pomočjo računalnika prenesti znani 3D proteinski model v umetno zgrajeno
enotno celico, ki ima enako orientacijo kot struktura za katero želimo dobiti 3D model. Za to
uporabimo različne rotacijske in translacijske funkcije.
52
METODA 1: MULTIPLA IZOMORFNA ZAMENJAVA
(ang. Mutiple Isomorphous Replacement - MIR)
MIR je najstarejša metoda reševanja faznega problema v kristalografiji in z njo so leta 1958 rešili
prvo kristalno strukturo mioglobina. Pri MIR z uvedbo „težkega atoma“ v proteinski kristal
spremenimo dobljeno difrakcijsko sliko. V ta namen uporabimo atome kot so: Pt, Pb, Hg. S
primerjavo dobljenih difrakacijskih slik proteinskih kristalov z vsebovanimi težkimi atomi in pa
brez njih, je mogoče določiti položaj (koordinate) težkih atomov ter tudi njihove faze. Nato
ocenimo vpliv uvedenega atoma na intenzitete preostalih difrakcijskih žarkov, ki izhajajo iz
proteinskih atomov, kar nam pomaga pri določitvi njihovih faz. Ponavadi pri tem pristopu
uporabljamo vsaj dva različna težka atoma (dva ločena eksperimenta), ki ju kristaliziramo skupaj
s proteinom. Metoda MIR tudi predpostavlja, da se dimenzija enotne celice ohranja pri vseh
eksperimentih in da imajo proteinski kristali definirano mesto vezave. Pri tej metodi pogosto
naletimo na težave, saj se proteinski kristali v prisotnosti težkih atomov ne tvorijo.
METODA 2: MULTIPLA ANOMALNA DISPERZIJA
(ang. Mutiple Anomalous Dispersion - MAD)
MAD je zelo podobna tehnika kot je MIR, le da tu uporabimo dejstvo, da atomi težkih atomov
pri določenih valovnih dolžinah anomalično razpršijo x-žarke s spremembo amplitude in faze.
Pri tej metodi lahko poleg prej omenjenih težkih atomov v strukturo proteina vključimo tudi
aminokislino selenometionin, ki namesto žvepla vsebuje z elektroni bogatejši atom selena. Za
uporabo MAD metode moramo zato biti sposobni proizvesti x-žarke z različnimi valovnimi
dolžinami, kar nam omogoča sinhrotron. Z merjenjem difrakcij pri teh izbranih valovnih dolžinah
lažje najdemo lokacijo in fazo težkega atoma oz. selenometionina. Analogno kot pri MIR metodi
se ti podatki nato uporabijo za določitev faz preostalih difraktiranih žarkov.
METODA 3: MOLEKULSKA ZAMENJAVA
(ang. Molecular Replacement - MR)
MR je najpogosteje uporabljena tehnika proteinske kristalografije, saj pogosto obstaja že
rešena 3D struktura homolognega proteina. Tako lahko kot začetne faze pri izračunu
elektronske gostote privzamemo kar te, ki so bile dobljene pri homologni strukturi, in jih
kombiniramo z dobljenimi intenzitetami odbojev. Metoda molekulske izmenjave je uporabna
le, če želimo določiti strukturo proteinu, ki je po primarni sekvenci vsaj v 25 % podoben
proteinu, za katerega 3D struktura že obstaja. Preden pričnemo z izračunom elektronske
gostote, moramo s pomočjo računalnika prenesti znani 3D proteinski model v umetno zgrajeno
enotno celico, ki ima enako orientacijo kot struktura za katero želimo dobiti 3D model. Za to
uporabimo različne rotacijske in translacijske funkcije.
52
