Page 65 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 65
strukture bioloških molekul
Pri enodimenzionalnih NMR spektrih smo imeli dve fazi eksperimeta - fazo vzbujanja z
aplikacijo RF valovanja in fazo FID, kjer smo detektirali izsevano energijo in generirali NMR
signal. Pri vseh večdimenzionalnih NMR eksperimentih pa je pulzna sekvenca nekoliko
drugačna. Pri 2D NMR eksperimentih je, kot smo omenili, pulzna sekvenca sestavljena iz
zaporedja vsaj dveh radiofrekvenčnih (RF) pulzov, ki sta ločena s časovnim intervalom. Skoraj
vsi 2D poskusi imajo štiri stopnje: (1) pripravljalna stopnja (ang. preparation period), kjer
vzbudimo jedra z aplikacijo prvega RF impulza. Tej sledi (2) evolucijska stopnja (ang. evolution
period), določeno časovno obdobje, v katerem pustimo magnetno aktivnim jedrom, da prosto
precesirajo kot posledico aplikacije začetnega impulza. V tretji (3) stopnji mešanja (ang. mixing
period) z drugo serijo RF impulzov ponovno vplivamo na magnetno aktivna jedra in nato v (4)
stopnji detekcije (ang. detection period) opazujemo »prosti indukcijski razpad« (ang. free
induction decay FID) vzorca kot funkcijo časa, na način, ki je enak enodimenzionalnemu FT-
NMR.
Po obdelavi podatkov 2D NMR spekter predstavimo z dvema frekvenčnima osema v obliki
kemijskega premika, kot smo to prikazali za enodimenzionalni primer. Vsaka frekvenčna os je
povezana z eno od dveh časovnih spremenljivk - to sta dolžina obdobja evolucije (čas evolucije)
in čas, ki preteče v obdobju zaznavanja (čas zaznavanja). Za pridobitev obeh moramo pridobljen
signal obdelati s Fourierjevo transformacijo. Intenzivnosti vrhov v 2D NMR spektru lahko
predstavimo z uvedbo tretje dimenzije, veliko bolj uveljavljen prikaz pa je s konturami.
Popularen 2D 1H NMR eksperiment je eksperiment homonuklearne korelacijske spektroskopije
(COrrelation SpectroscopY - COSY). Sestavljen je iz enega RF impulza (p1), ki mu sledi določen
čas evolucije (t1). Temu sledi mešanje z uvedbo drugega impulza (p2) ter obdobje merjenja
(t2). 2D COSY 1H NMR eksperiment omogoča prepoznavanje interakcij sosednjih protonov, ki
se nahajajo ponavadi največ 3 kovalentne vezi narazen in predstavljajo interkacijo jeder skozi
vezi (Slika 7). Na primeru aminokisline valina si lahko pogledamo, da signali za isti proton (npr.
NH, Ha, Hb, Hg) v 2D COSY spektru ležijo na diagonali. V primeru, da pride do interakcije
protonov, ki so oddaljeni za tri vezi (npr. NH : Ha in Ha : Hb), dobimo signal, ki ne leži na
diagonali in kaže na skopljenost teh dveh magnetno aktivnih jeder, ker sta oddaljena med seboj
za 3 kovalentne vezi.
Ker nas NMR spektroskopija tu zanima predvsem zaradi določanja 3D strukture proteinov, je
pomembno vedeti, da ima več aminokislin zelo podobne 2D NMR COSY vzorce, ki jih med seboj
težko ločimo. Zato pogosto uporabljamo še drug homonuklearen NMR eksperiment, kjer lahko
detektiramo interakcijo protonov tudi preko več kot treh kovalentnih vezi. Ta 2D NMR tehnika
se imenuje homonuklearna popolna korelacijska NMR spektroskopija oz. 2D TOCSY (TOtal
Correlation Spectroscopy). 2D TOCSY NMR spekter je nekakšen generaliziran 2D COSY spekter.
V TOCSY spektru navzkrižne korelacijske vrhove opazimo ne le za jedra (protone), ki so
neposredno povezana preko nosilne C-C vezi (sklopitev preko 3 vezi), temveč tudi med bolj
oddaljenimi jedri na skupni nosilni verigi. To si lahko ogledamo na 2D TOCSY spektru na Sliki 7.
To opažanje s pridom uporabimo za prepoznavanje večjih medsebojno povezanih mrež
magnetno aktivnih protonov na stranskih verigah aminokislin. Da lahko opazimo tak efekt, v
pulzni sekvenci apliciramo več ponavljajočih se RF impulzov, ki med fazo mešanja povzročajo
izotropno mešanje jeder. Daljši časi mešanja povzročijo, da se polarizacija širi preko večjega
števila vezi kot pri COSY eksperimentu. Na primeru aminokisline valina na Sliki 7 vidimo, da
65
Pri enodimenzionalnih NMR spektrih smo imeli dve fazi eksperimeta - fazo vzbujanja z
aplikacijo RF valovanja in fazo FID, kjer smo detektirali izsevano energijo in generirali NMR
signal. Pri vseh večdimenzionalnih NMR eksperimentih pa je pulzna sekvenca nekoliko
drugačna. Pri 2D NMR eksperimentih je, kot smo omenili, pulzna sekvenca sestavljena iz
zaporedja vsaj dveh radiofrekvenčnih (RF) pulzov, ki sta ločena s časovnim intervalom. Skoraj
vsi 2D poskusi imajo štiri stopnje: (1) pripravljalna stopnja (ang. preparation period), kjer
vzbudimo jedra z aplikacijo prvega RF impulza. Tej sledi (2) evolucijska stopnja (ang. evolution
period), določeno časovno obdobje, v katerem pustimo magnetno aktivnim jedrom, da prosto
precesirajo kot posledico aplikacije začetnega impulza. V tretji (3) stopnji mešanja (ang. mixing
period) z drugo serijo RF impulzov ponovno vplivamo na magnetno aktivna jedra in nato v (4)
stopnji detekcije (ang. detection period) opazujemo »prosti indukcijski razpad« (ang. free
induction decay FID) vzorca kot funkcijo časa, na način, ki je enak enodimenzionalnemu FT-
NMR.
Po obdelavi podatkov 2D NMR spekter predstavimo z dvema frekvenčnima osema v obliki
kemijskega premika, kot smo to prikazali za enodimenzionalni primer. Vsaka frekvenčna os je
povezana z eno od dveh časovnih spremenljivk - to sta dolžina obdobja evolucije (čas evolucije)
in čas, ki preteče v obdobju zaznavanja (čas zaznavanja). Za pridobitev obeh moramo pridobljen
signal obdelati s Fourierjevo transformacijo. Intenzivnosti vrhov v 2D NMR spektru lahko
predstavimo z uvedbo tretje dimenzije, veliko bolj uveljavljen prikaz pa je s konturami.
Popularen 2D 1H NMR eksperiment je eksperiment homonuklearne korelacijske spektroskopije
(COrrelation SpectroscopY - COSY). Sestavljen je iz enega RF impulza (p1), ki mu sledi določen
čas evolucije (t1). Temu sledi mešanje z uvedbo drugega impulza (p2) ter obdobje merjenja
(t2). 2D COSY 1H NMR eksperiment omogoča prepoznavanje interakcij sosednjih protonov, ki
se nahajajo ponavadi največ 3 kovalentne vezi narazen in predstavljajo interkacijo jeder skozi
vezi (Slika 7). Na primeru aminokisline valina si lahko pogledamo, da signali za isti proton (npr.
NH, Ha, Hb, Hg) v 2D COSY spektru ležijo na diagonali. V primeru, da pride do interakcije
protonov, ki so oddaljeni za tri vezi (npr. NH : Ha in Ha : Hb), dobimo signal, ki ne leži na
diagonali in kaže na skopljenost teh dveh magnetno aktivnih jeder, ker sta oddaljena med seboj
za 3 kovalentne vezi.
Ker nas NMR spektroskopija tu zanima predvsem zaradi določanja 3D strukture proteinov, je
pomembno vedeti, da ima več aminokislin zelo podobne 2D NMR COSY vzorce, ki jih med seboj
težko ločimo. Zato pogosto uporabljamo še drug homonuklearen NMR eksperiment, kjer lahko
detektiramo interakcijo protonov tudi preko več kot treh kovalentnih vezi. Ta 2D NMR tehnika
se imenuje homonuklearna popolna korelacijska NMR spektroskopija oz. 2D TOCSY (TOtal
Correlation Spectroscopy). 2D TOCSY NMR spekter je nekakšen generaliziran 2D COSY spekter.
V TOCSY spektru navzkrižne korelacijske vrhove opazimo ne le za jedra (protone), ki so
neposredno povezana preko nosilne C-C vezi (sklopitev preko 3 vezi), temveč tudi med bolj
oddaljenimi jedri na skupni nosilni verigi. To si lahko ogledamo na 2D TOCSY spektru na Sliki 7.
To opažanje s pridom uporabimo za prepoznavanje večjih medsebojno povezanih mrež
magnetno aktivnih protonov na stranskih verigah aminokislin. Da lahko opazimo tak efekt, v
pulzni sekvenci apliciramo več ponavljajočih se RF impulzov, ki med fazo mešanja povzročajo
izotropno mešanje jeder. Daljši časi mešanja povzročijo, da se polarizacija širi preko večjega
števila vezi kot pri COSY eksperimentu. Na primeru aminokisline valina na Sliki 7 vidimo, da
65
