Page 68 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 68
andrej perdih, katja lakota, alja prah
verigah. V praksi pogosto zaradi prisotnih številnih drugih dejavnikov v NMR spektru niso vidni
vsi vrhovi.
HSQC 2D NMR poskus je zelo občutljiv in ga je mogoče izvesti razmeroma hitro. Gre za enega
standardnih eksperimentov, ki se uporabljajo za določanje 3D strukture proteina. Pogosto se
uporablja že za preverjanje primernosti proteina za določanje strukture z uporabo NMR. HSQC
NMR obstaja še v dodatnih različicah, kot sta 1H-15N TOCSY-HSQC in 11H-15N NOESY-HSQC.
Poleg 2D HSQC eksperimenta obstaja tudi HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation)
NMR spektroskopija, ki omogoča detekcijo korelacije med dvema različnima magnetno
aktivnima jedroma preko daljše razdalje, ponavadi preko 2 do 4 kovalentnih vezi.
Za konec omenimo še heteronuklearne 3D NMR eksperimente, kjer opazujemo in detektiramo
prenos magnetizacije preko treh različnih magnetno aktivnih jeder. Imenujemo jih tudi trojni
resonančni eksperimenti (ang. triple resonance experiments). Jedra, ki jih uporabljamo so v ta
namen so 1H, 15N and 13C jeder. Zaradi več prisotnih „dimenzij“ in sklapljanj prek različnih jeder
je asignacija signalov lažja.
Pri trojnih resonančnih eksperimentih vzamemo za izhodišče peptidno ogrodje, ki ga sestavljajo
atomi CA-C(O)-NH, ki so vsi magnetno aktivni. Z uporabo specifični pulznih sekvenc lahko nato
selektivno opazujemo prenos magnetizacije med temi atomi peptidnega ogrodja. Ime trojnega
resonančnega eskperimenta je odvisno od tega, kako se magnetizacija, glede na uporabljeno
pulzno sekvenco, prenaša preko peptidne vezi Tako poznamo (1) HNCO, (2) HN (CA) CO, (3)
HNCA, (4) HN (CO) CA, (5) HNCACB in (6) CBCA (CO) NH trojne resonančne eksperimente.
Magnetna jedra v imenu posameznega eksperimenta so razvrščena v istem zaporedju kot
poteka prenos magnetizacije. Če so jedra navedena v oklepajih, to pomeni, da so vključena v
pot prenosa magnetizacije, vendar za njih ne merimo signalov. Pri vseh šestih izvedenkah
imamo v 2D spektru spodaj 1H-15N ravnino, ki je podobna kot 2D spekter HSQC, ki jo v 3D
razširimo s 13C dimenzijo (Slika 8). Velikokrat te 3D spektre vizualiziramo kot »rezine« različnih
2D NMR spektrov, ki jih za lažjo interpretacijo podatkov izrežemo iz celotnega 3D spektra pri
konstantnem kemijskem premiku enega izmed magnetnih jeder.
5. DOLOČANJE 3D STRUKTURE PROTEINOV Z NMR SPEKTROSKOPIJO
NMR spektroskopija se uporablja tudi za določanje 3D strukture proteinov. Prednost pred
rentgensko kristalografijo je tudi v tem, da poleg strukturnih podatkov NMR poda tudi veliko
podatkov o dinamiki proteinov in njihovih kompleksov. Poleg tega dobimo podatke o strukturi
v raztopini, kar ustreza fiziološkim pogojem.
Tehniko so v drugi polovici 20. stoletja razvili raziskovalci Richard R. Ernst in Kurt Wüthrich na
ETH v Švici ter Ad Bax, Marius Clore in Angela Gronenborn na National Institute of Health (NIH)
v ZDA. Prvi mejnik se je zgodil leta 1957, ko je bil objavljen prvi NMR spekter proteina. Leta
1980 je Kurt Wüthrich opisal metodo določanja strukture proteina z NMR spektroskopijo, ki so
jo kasneje prej omenjeni raziskovalci optimizirali in izboljšali. Leta 1986 je bila določena 3D
struktura proteina tako z NMR spektroskopijo kot tudi s proteinsko kristalografijo, kar je
omogočilo primerjavo rezultatov. Leta 2002 pa je Kurt Wüthrich prejel Nobelovo nagrado za
kemijo za dosežke na področju določanja proteinske strukture z NMR.
68
verigah. V praksi pogosto zaradi prisotnih številnih drugih dejavnikov v NMR spektru niso vidni
vsi vrhovi.
HSQC 2D NMR poskus je zelo občutljiv in ga je mogoče izvesti razmeroma hitro. Gre za enega
standardnih eksperimentov, ki se uporabljajo za določanje 3D strukture proteina. Pogosto se
uporablja že za preverjanje primernosti proteina za določanje strukture z uporabo NMR. HSQC
NMR obstaja še v dodatnih različicah, kot sta 1H-15N TOCSY-HSQC in 11H-15N NOESY-HSQC.
Poleg 2D HSQC eksperimenta obstaja tudi HMBC (Heteronuclear Multiple-Bond Correlation)
NMR spektroskopija, ki omogoča detekcijo korelacije med dvema različnima magnetno
aktivnima jedroma preko daljše razdalje, ponavadi preko 2 do 4 kovalentnih vezi.
Za konec omenimo še heteronuklearne 3D NMR eksperimente, kjer opazujemo in detektiramo
prenos magnetizacije preko treh različnih magnetno aktivnih jeder. Imenujemo jih tudi trojni
resonančni eksperimenti (ang. triple resonance experiments). Jedra, ki jih uporabljamo so v ta
namen so 1H, 15N and 13C jeder. Zaradi več prisotnih „dimenzij“ in sklapljanj prek različnih jeder
je asignacija signalov lažja.
Pri trojnih resonančnih eksperimentih vzamemo za izhodišče peptidno ogrodje, ki ga sestavljajo
atomi CA-C(O)-NH, ki so vsi magnetno aktivni. Z uporabo specifični pulznih sekvenc lahko nato
selektivno opazujemo prenos magnetizacije med temi atomi peptidnega ogrodja. Ime trojnega
resonančnega eskperimenta je odvisno od tega, kako se magnetizacija, glede na uporabljeno
pulzno sekvenco, prenaša preko peptidne vezi Tako poznamo (1) HNCO, (2) HN (CA) CO, (3)
HNCA, (4) HN (CO) CA, (5) HNCACB in (6) CBCA (CO) NH trojne resonančne eksperimente.
Magnetna jedra v imenu posameznega eksperimenta so razvrščena v istem zaporedju kot
poteka prenos magnetizacije. Če so jedra navedena v oklepajih, to pomeni, da so vključena v
pot prenosa magnetizacije, vendar za njih ne merimo signalov. Pri vseh šestih izvedenkah
imamo v 2D spektru spodaj 1H-15N ravnino, ki je podobna kot 2D spekter HSQC, ki jo v 3D
razširimo s 13C dimenzijo (Slika 8). Velikokrat te 3D spektre vizualiziramo kot »rezine« različnih
2D NMR spektrov, ki jih za lažjo interpretacijo podatkov izrežemo iz celotnega 3D spektra pri
konstantnem kemijskem premiku enega izmed magnetnih jeder.
5. DOLOČANJE 3D STRUKTURE PROTEINOV Z NMR SPEKTROSKOPIJO
NMR spektroskopija se uporablja tudi za določanje 3D strukture proteinov. Prednost pred
rentgensko kristalografijo je tudi v tem, da poleg strukturnih podatkov NMR poda tudi veliko
podatkov o dinamiki proteinov in njihovih kompleksov. Poleg tega dobimo podatke o strukturi
v raztopini, kar ustreza fiziološkim pogojem.
Tehniko so v drugi polovici 20. stoletja razvili raziskovalci Richard R. Ernst in Kurt Wüthrich na
ETH v Švici ter Ad Bax, Marius Clore in Angela Gronenborn na National Institute of Health (NIH)
v ZDA. Prvi mejnik se je zgodil leta 1957, ko je bil objavljen prvi NMR spekter proteina. Leta
1980 je Kurt Wüthrich opisal metodo določanja strukture proteina z NMR spektroskopijo, ki so
jo kasneje prej omenjeni raziskovalci optimizirali in izboljšali. Leta 1986 je bila določena 3D
struktura proteina tako z NMR spektroskopijo kot tudi s proteinsko kristalografijo, kar je
omogočilo primerjavo rezultatov. Leta 2002 pa je Kurt Wüthrich prejel Nobelovo nagrado za
kemijo za dosežke na področju določanja proteinske strukture z NMR.
68
