Page 70 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 70
andrej perdih, katja lakota, alja prah
pa prenos magnetizacije poteka skozi prostor in ne preko vezi: to sta predvsem 2D NOESY in
2D ROESY NMR eksperimenta. Prvi tip NMR eksperimentov uporabljamo predvsem za
asignacijo kemijskih premikov določenemu jedru (protonu), z drugim tipom (deloma pa tudi s
prvim) pa pridobimo ustrezne prostorske omejitve, ki jih potrebujemo za izračun 3D strukture.
Če imamo izotopsko označen protein, navadno z izotopom 15N poskusimo najprej posneti 2D
1H-15N HSQC NMR spekter. Ta NMR spekter prikaže korelacije med 15N dušikom in nanj
kovalentno vezanim protonom. Tako dobimo v spektru, kot smo že omenili, signal za vse
amidne vezi glavne proteinske verige brez prolina. Poleg tega vse aminokisline, ki imajo v svoji
stranski verigi N-H segment (aminokisline Trp, Asn, Gln, Arg, His in Lys), dajo še dodatne signale.
1H-15N HSQC NMR spekter se pogosto imenuje kar »prstni odtis proteina«, saj ima vsak protein
edinstven vzorec. Analiza 1H-15N HSQC spektra raziskovalcem omogoča, da ocenijo, ali je v njem
prisotno pričakovano število signalov in s tem prepoznajo morebitne težave zaradi različnih
konformacij ali heterogenosti vzorca. Ta sorazmerno hiter heteronuklearni NMR eksperiment
pomaga pri odločitvi ali izvedemo nadaljnje zahtevnejše večdimenzionalne heteronuklearne
NMR eksperimente.
Če smo protein označili s 13C izotopom in imamo zadosti zmogljiv NMR spektrometer, izvedemo
tudi trojne resonančne eksperimente, ki smo jih že predstavili, kot so (1) HNCO, (2) HN (CA)
CO, (3) HNCA, (4) HN (CO) CA, (5) HNCACB in (6) CBCA (CO) NH NMR eksperimenti. Pridobljeni
kompleksni 3D NMR spektri bodo omogočili lažjo asignacijo signalov magnetno aktivnim
jedrom.
Odvisno od koncentracije vzorca, moči magnetnega polja NMR spektrometra ter vrste
eksperimentov lahko izvedba večdimenzionalnih NMR poskusov traja več ur ali celo več dni, da
dobimo dovolj močan signal za generiranje uporabnega NMR spektra. Več dimenzij vključenih
v eksperiment (2D v primerjavi s 3D NMR) le še podaljša čas meritev.
C) SEKVENČNA ASIGNACIJA NMR SIGNALOV
V naslednjem koraku analiziramo pridobljene NMR spektre in asigniramo vse nastale signale k
prisotnim magnetno aktivnim jedrom, ki sestavljajo protein. To običajno dosežemo s t. i.
sekvenčno asignacijo (ang. sequential asignation) z uporabo informacij, pridobljenih iz NMR
eksperimentov. Postopek asignacije je odvisen tudi od tega, ali smo protein izotopsko označili,
saj nam heteronuklearni NMR spektri z uporabo izotopov 15N in 13C omogočijo lažjo
identifikacijo posameznih signalov.
Če protein ni bil izotopsko označen, poskusimo z uporabo 2D eksperimentov asignirati vse
protone. To tehniko je prvi uporabil Kurt Wüthrich. Najprej uporabimo homonuklearne 2D
COSY in 2D TOCSY spektre, ki omogočajo zaznavo tistih protonov, ki so povezani preko
kemijskih vezi. Kot že omenjeno, COSY spekter prikaže interakcijo med protoni, vezanimi na
sosednje C atome, TOSCY pa omogoča zaznavo interakcije protonov, ki so oddaljeni tudi za več
C atomov. Tako na primer v 2D COSY spektru α proton aminokisline zaradi prenosa
magnetizacije da signal z β protoni. Analogno β protoni dajo signal z α in γ protoni, če so v
preiskovani aminokislini seveda prisotni, ter γ protoni z β in δ protoni. V 2D TOCSY NMR spektih
α proton in posledično vsi drugi protoni magnetizirajo vse preostale prisotne protone (npr. β,
γ, δ), če so le-ti prisotni in povezani z neprekinjeno stransko verigo posamezne aminokisline.
70
pa prenos magnetizacije poteka skozi prostor in ne preko vezi: to sta predvsem 2D NOESY in
2D ROESY NMR eksperimenta. Prvi tip NMR eksperimentov uporabljamo predvsem za
asignacijo kemijskih premikov določenemu jedru (protonu), z drugim tipom (deloma pa tudi s
prvim) pa pridobimo ustrezne prostorske omejitve, ki jih potrebujemo za izračun 3D strukture.
Če imamo izotopsko označen protein, navadno z izotopom 15N poskusimo najprej posneti 2D
1H-15N HSQC NMR spekter. Ta NMR spekter prikaže korelacije med 15N dušikom in nanj
kovalentno vezanim protonom. Tako dobimo v spektru, kot smo že omenili, signal za vse
amidne vezi glavne proteinske verige brez prolina. Poleg tega vse aminokisline, ki imajo v svoji
stranski verigi N-H segment (aminokisline Trp, Asn, Gln, Arg, His in Lys), dajo še dodatne signale.
1H-15N HSQC NMR spekter se pogosto imenuje kar »prstni odtis proteina«, saj ima vsak protein
edinstven vzorec. Analiza 1H-15N HSQC spektra raziskovalcem omogoča, da ocenijo, ali je v njem
prisotno pričakovano število signalov in s tem prepoznajo morebitne težave zaradi različnih
konformacij ali heterogenosti vzorca. Ta sorazmerno hiter heteronuklearni NMR eksperiment
pomaga pri odločitvi ali izvedemo nadaljnje zahtevnejše večdimenzionalne heteronuklearne
NMR eksperimente.
Če smo protein označili s 13C izotopom in imamo zadosti zmogljiv NMR spektrometer, izvedemo
tudi trojne resonančne eksperimente, ki smo jih že predstavili, kot so (1) HNCO, (2) HN (CA)
CO, (3) HNCA, (4) HN (CO) CA, (5) HNCACB in (6) CBCA (CO) NH NMR eksperimenti. Pridobljeni
kompleksni 3D NMR spektri bodo omogočili lažjo asignacijo signalov magnetno aktivnim
jedrom.
Odvisno od koncentracije vzorca, moči magnetnega polja NMR spektrometra ter vrste
eksperimentov lahko izvedba večdimenzionalnih NMR poskusov traja več ur ali celo več dni, da
dobimo dovolj močan signal za generiranje uporabnega NMR spektra. Več dimenzij vključenih
v eksperiment (2D v primerjavi s 3D NMR) le še podaljša čas meritev.
C) SEKVENČNA ASIGNACIJA NMR SIGNALOV
V naslednjem koraku analiziramo pridobljene NMR spektre in asigniramo vse nastale signale k
prisotnim magnetno aktivnim jedrom, ki sestavljajo protein. To običajno dosežemo s t. i.
sekvenčno asignacijo (ang. sequential asignation) z uporabo informacij, pridobljenih iz NMR
eksperimentov. Postopek asignacije je odvisen tudi od tega, ali smo protein izotopsko označili,
saj nam heteronuklearni NMR spektri z uporabo izotopov 15N in 13C omogočijo lažjo
identifikacijo posameznih signalov.
Če protein ni bil izotopsko označen, poskusimo z uporabo 2D eksperimentov asignirati vse
protone. To tehniko je prvi uporabil Kurt Wüthrich. Najprej uporabimo homonuklearne 2D
COSY in 2D TOCSY spektre, ki omogočajo zaznavo tistih protonov, ki so povezani preko
kemijskih vezi. Kot že omenjeno, COSY spekter prikaže interakcijo med protoni, vezanimi na
sosednje C atome, TOSCY pa omogoča zaznavo interakcije protonov, ki so oddaljeni tudi za več
C atomov. Tako na primer v 2D COSY spektru α proton aminokisline zaradi prenosa
magnetizacije da signal z β protoni. Analogno β protoni dajo signal z α in γ protoni, če so v
preiskovani aminokislini seveda prisotni, ter γ protoni z β in δ protoni. V 2D TOCSY NMR spektih
α proton in posledično vsi drugi protoni magnetizirajo vse preostale prisotne protone (npr. β,
γ, δ), če so le-ti prisotni in povezani z neprekinjeno stransko verigo posamezne aminokisline.
70
