Page 67 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 67
strukture bioloških molekul
ROESY NMR spektroskopiji določene spine v fazi mešanja zaklenemo in s tem omogočimo lažjo
detekcijo interakcij jeder preko prostora.
Pri manjših proteinih in peptidih prej omenjeni homonuklearni 2D NMR spektri pogosto
omogočajo določitev 3D strukture. Pri večjih proteinih pa pri homonuklearnih 2D NMR 1H
eksperimentih lahko pride do prevelikega prekrivanja dobljenih signalov, saj imajo različni
protoni enake ali zelo podobne kemijske premike. Zato za večje proteine kombinacija 1H 2D
NOESY in 2D COSY spektrov pogosoto ne zadostuje več za določitev 3D strukture. V ta namen
pričnemo izvajati še heteronuklearne 2D NMR eksperimente, kjer dobljeni signali temeljijo na
spajanju magnetno aktivnih jeder dveh različnih vrst. Pogosto sta ti dve jedri proton 1H in neko
drugo magnetno aktivno jedro. Najpogosteje uporabimo magnetno aktivna jedra izotopa
dušika 15N in ogljika 13C. Ker je le-teh v naravi malo, moramo protein, ki ga uporabimo za NMR
eksperiment, pridobiti tako, da ga obogatimo s temi magnetno aktivnimi jedri. To je večinoma
drag in dolgotrajen postopek, vendar je pri nekaterih proteinih nujen za določitev 3D strukture.
Izotopsko označene proteine dobimo tako, da bakterije razmnožujemo v okolju z izotopsko
označenimi hranili.
Slika 8. (Levo) 1H-15N HSQC NMR in primer na rezine razdeljenega NMR spektra, ki ga dobimo
s trojnimi resonančnimi eksperimenti. (Desno) Shematski prikaz različnih 2D NMR
eksperimentov, ki jih uporabljamo pri določitvi 3D strukture proteinov.
Najpogosteje uporabljeni heteronuklearni eksperiment je 1H-15N HSQC (Heteronuclear Single-
Quantum Correlation) NMR spektroskopija. Ta 2D NMR poskus zazna interakcije med
magnetno aktivnimi jedri dveh različnih vrst, ki so ločena z eno kovalentno vezjo, konkretno
med dušikom 15N in protonom 1H. Kot rezultat dobimo v 2D NMR spektru signal za par
sklopljenih jeder, katerih koordinati sta kemijska premika za oba atoma (Slika 8). To je posebej
uporabno pri določanju 3D strukture proteinov, saj imajo vse aminokisline, razen prolina
amidni proton H vezan na dušikov atom N kot del peptidne vezi in v HSQC NMR spektru to
lahko zaznamo. V spektru dobimo dodatne signale za vse N-H elemente, prisotne v stranskih
67
ROESY NMR spektroskopiji določene spine v fazi mešanja zaklenemo in s tem omogočimo lažjo
detekcijo interakcij jeder preko prostora.
Pri manjših proteinih in peptidih prej omenjeni homonuklearni 2D NMR spektri pogosto
omogočajo določitev 3D strukture. Pri večjih proteinih pa pri homonuklearnih 2D NMR 1H
eksperimentih lahko pride do prevelikega prekrivanja dobljenih signalov, saj imajo različni
protoni enake ali zelo podobne kemijske premike. Zato za večje proteine kombinacija 1H 2D
NOESY in 2D COSY spektrov pogosoto ne zadostuje več za določitev 3D strukture. V ta namen
pričnemo izvajati še heteronuklearne 2D NMR eksperimente, kjer dobljeni signali temeljijo na
spajanju magnetno aktivnih jeder dveh različnih vrst. Pogosto sta ti dve jedri proton 1H in neko
drugo magnetno aktivno jedro. Najpogosteje uporabimo magnetno aktivna jedra izotopa
dušika 15N in ogljika 13C. Ker je le-teh v naravi malo, moramo protein, ki ga uporabimo za NMR
eksperiment, pridobiti tako, da ga obogatimo s temi magnetno aktivnimi jedri. To je večinoma
drag in dolgotrajen postopek, vendar je pri nekaterih proteinih nujen za določitev 3D strukture.
Izotopsko označene proteine dobimo tako, da bakterije razmnožujemo v okolju z izotopsko
označenimi hranili.
Slika 8. (Levo) 1H-15N HSQC NMR in primer na rezine razdeljenega NMR spektra, ki ga dobimo
s trojnimi resonančnimi eksperimenti. (Desno) Shematski prikaz različnih 2D NMR
eksperimentov, ki jih uporabljamo pri določitvi 3D strukture proteinov.
Najpogosteje uporabljeni heteronuklearni eksperiment je 1H-15N HSQC (Heteronuclear Single-
Quantum Correlation) NMR spektroskopija. Ta 2D NMR poskus zazna interakcije med
magnetno aktivnimi jedri dveh različnih vrst, ki so ločena z eno kovalentno vezjo, konkretno
med dušikom 15N in protonom 1H. Kot rezultat dobimo v 2D NMR spektru signal za par
sklopljenih jeder, katerih koordinati sta kemijska premika za oba atoma (Slika 8). To je posebej
uporabno pri določanju 3D strukture proteinov, saj imajo vse aminokisline, razen prolina
amidni proton H vezan na dušikov atom N kot del peptidne vezi in v HSQC NMR spektru to
lahko zaznamo. V spektru dobimo dodatne signale za vse N-H elemente, prisotne v stranskih
67
