Page 69 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 69
strukture bioloških molekul
Najprej predstavimo osnovni ideji NMR spektroskopije proteinov, kot to prikazuje Slika 9.
Posamezne korake metode, ki so prav tako predstavljeni na tej sliki, bomo nato natančneje
razložili v nadaljevanju.
1. IDEJA: S pomočjo različnih homonuklearnih in heteronuklearnih NMR eksperimentov
pridobimo 2D in 3D NMR spektre, ki bodo z metodo sekvenčne asignacije omogočili določitev
položajev vseh preiskovanih magnetno aktivnih jeder v preiskovani biološki molekuli ter
identifikacijo geometrijskih omejitvev - vezne razdalje in vrednosti torzijskih kotov med njimi.
2. IDEJA: S pomočjo računskih metod izračunamo 3D strukturo proteina, ki ustreza dobljenim
geometrijskim omejitvam.
Slika 9. Osnovna ideja proteinske NMR spektroskopije in koraki proteinske NMR spektroskopije.
A) PRIPRAVA VZORCA
Za pričetek NMR eksperimenta potrebujemo raztopino dobro očiščenega proteina. Običajno je
volumen vzorca med 300 in 600 μL, koncentracija proteina pa med 0.1 in 3 mmol. Podobno
kot pri rentgenski kristalografiji lahko protein pridobimo iz naravnih virov ali s pomočjo
rekombinantnih DNA tehnik z genskim inženiringom. Slednje omogoča lažjo produkcijo
zadostne količine proteina in tudi izotopsko označevanje proteina, npr. izotopa dušika 15N in
ogljika 13C za heteronuklearne NMR eksperimente. Očiščen pripravljen protein nato raztopimo
v ustrezni raztopini pufra. Vzorec za NMR meritev pripravimo v posebni stekleni cevki s tanko
steno.
B) IZVEDBA NMR EKSPERIMENTOV
Za določitev 3D strukture proteina je potrebno izvesti več večdimenzionalnih NMR
eksperimentov. Za to uporabimo različne kombinacije pulznih sekvenc, ki omogočajo
generiranje takih NMR spektrov. Kot smo omenili, ponavadi posnamemo dva tipa
homonuklearnih NMR eksperimentov. Prvi tip je tisti, pri katerem detektiramo prenos
magnetizacije med kemijskimi vezmi (npr. 2D COSY in TOSCY eksperimenta). Pri drugem tipu
69
Najprej predstavimo osnovni ideji NMR spektroskopije proteinov, kot to prikazuje Slika 9.
Posamezne korake metode, ki so prav tako predstavljeni na tej sliki, bomo nato natančneje
razložili v nadaljevanju.
1. IDEJA: S pomočjo različnih homonuklearnih in heteronuklearnih NMR eksperimentov
pridobimo 2D in 3D NMR spektre, ki bodo z metodo sekvenčne asignacije omogočili določitev
položajev vseh preiskovanih magnetno aktivnih jeder v preiskovani biološki molekuli ter
identifikacijo geometrijskih omejitvev - vezne razdalje in vrednosti torzijskih kotov med njimi.
2. IDEJA: S pomočjo računskih metod izračunamo 3D strukturo proteina, ki ustreza dobljenim
geometrijskim omejitvam.
Slika 9. Osnovna ideja proteinske NMR spektroskopije in koraki proteinske NMR spektroskopije.
A) PRIPRAVA VZORCA
Za pričetek NMR eksperimenta potrebujemo raztopino dobro očiščenega proteina. Običajno je
volumen vzorca med 300 in 600 μL, koncentracija proteina pa med 0.1 in 3 mmol. Podobno
kot pri rentgenski kristalografiji lahko protein pridobimo iz naravnih virov ali s pomočjo
rekombinantnih DNA tehnik z genskim inženiringom. Slednje omogoča lažjo produkcijo
zadostne količine proteina in tudi izotopsko označevanje proteina, npr. izotopa dušika 15N in
ogljika 13C za heteronuklearne NMR eksperimente. Očiščen pripravljen protein nato raztopimo
v ustrezni raztopini pufra. Vzorec za NMR meritev pripravimo v posebni stekleni cevki s tanko
steno.
B) IZVEDBA NMR EKSPERIMENTOV
Za določitev 3D strukture proteina je potrebno izvesti več večdimenzionalnih NMR
eksperimentov. Za to uporabimo različne kombinacije pulznih sekvenc, ki omogočajo
generiranje takih NMR spektrov. Kot smo omenili, ponavadi posnamemo dva tipa
homonuklearnih NMR eksperimentov. Prvi tip je tisti, pri katerem detektiramo prenos
magnetizacije med kemijskimi vezmi (npr. 2D COSY in TOSCY eksperimenta). Pri drugem tipu
69
