Page 71 - Perdih, Andrej, Katja Lakota, Alja Prah. 2020. Strukture bioloških molekul. Univerzitetni učbenik z recenzijo in navodila za vaje. Koper: Založba Univerze na Primorskem.
P. 71
strukture bioloških molekul
2D COSY in 2D TOCSY NMR eksperimenta omogočata izgradnjo spin sistemov (ang. spin
system), za posamezne aminokisline, ki jih sestavlja seznam karakterističnih kemijskih premikov
peptidnega protona, α protona in preostalih protonov v stranskih verigah. Ko identificiramo
spinske sisteme posameznih aminokislin, jih poskušamo povezati med seboj z uporabo 2D
NOESY NMR spektrov. Kot sedaj že vemo, NOESY eksperimenti omogočajo interakcijo protonov
preko prostora in zato bomo v spektru opazili signale za protone, ki so prostorsko blizu skupaj,
ne glede na to, ali so del istega spinskega sistema ali ne. S kombinacijo obeh pristopov lahko za
manjše proteine (nekje do velikosti 10 kDa), ob poznavanju primarne sekvence, asigniramo
vsak signal posamezni aminokislini. Pri večjih proteinih pri homonuklearnih 2D NMR
eksperimentih opazimo močno prekrivanje signalov, saj imajo določeni protoni zelo podobne
ali pa celo identične kemijske premike in jih ne moremo ločiti. Z večanjem velikosti proteina ta
težava postaja le še bolj izrazita.
Pri večjih proteinih moramo zato protein obogatiti z drugimi magnetno aktivnimi jedri,
predvsem 15N in 13C, da lahko s pomočjo heteronuklearnih 2D in 3D NMR eskperimentov
asigniramo vse signale. Najprej navadno posnamemo »prstni odtis proteina« oz. 1H-15N HSQC
NMR spekter. Ta sorazmerno hiter heteronuklearni NMR eksperiment pomaga pri odločitvi, ali
izvedemo nadaljnje zahtevnejše večdimenzionalne heteronuklearne NMR eksperimente. Prav
tako podatke iz spektra uporabimo za lažjo asignacijo amidnih protonov in protonov stranske
verige proteina, ki so vezani na dušik, saj oboji dajejo signal pri tem eksperimentu. Nadalje se
lahko poslužimo še 15N NOESY-HSQC in 15N TOCSY-HSQC različice NMR eksperimentov, ki
podajo še natančnejše informacije tako skapljanja protona z jedrom 15N preko vezi kot tudi
preko prostora.
Če je protein označen še z jedrom 13C, izvedemo še različne trojne resonančne NMR
eksperimente, ki nam pokažejo, kako se prenaša magnetizacija preko amidne (oz. peptidne
vezi) v proteinih. Dobimo več 3D NMR spektrov, ki nam omogočajo, da signale ločimo in tako
lažje pripišemo posamezni signal specifičnemu magnetnemu jedru.
D) ZBIRANJE KONFORMACIJSKIH OMEJITEV
Ko imamo enkrat vse NMR signale asignirane k posameznim magnetno aktivnim jedrom
preiskovanega proteina, nas zanimajo prostorske omejitve med njimi. Glavna parametra, ki jih
potrebujemo, sta omejitvi razdalj (ang. distance restrains) in omejitve kotov (ang. angle
restrains) med njimi. Ti podatki nam bodo v pomoč pri izračunu končne 3D konformacije
proteina.
Največ prostorskih omejitev dobimo iz 2D NOESY eksperimentov. Dobljeni NOESY signal med
dvema jedroma nakazuje, da sta le-ti prostorsko blizu skupaj. Navadno je ta razdalja v intervalu
med 1.8 in 6 Å, kjer lahko opazimo NOE. Intenzivnost posameznega NOESY signala je
sorazmerna z 1/r-6 razdalje med jedroma, in tako, glede na intenziteto vrha, lahko ocenimo
razdaljo med jedroma. Razmerje med intenziteto in razdaljo s to zvezo je le približno, zato
običajno določimo interval razdalje za vsako indetificirano interakcijo med jedri. Proces
identifikacije in ocene razdalj je navadno časovno zelo zahteven in pri tem uporabljamo več
računalniških programov, kot so PASD, XPLOR-NIH, UNIO, CYANA, ARIA in drugi. Uporaba 15N
in 13N NOESY NMR eksperimentov še poveča kvaliteto pridobljenih podatkov, saj omogoča
boljšo ločitev in asignacijo dobljenih signalov.
71
2D COSY in 2D TOCSY NMR eksperimenta omogočata izgradnjo spin sistemov (ang. spin
system), za posamezne aminokisline, ki jih sestavlja seznam karakterističnih kemijskih premikov
peptidnega protona, α protona in preostalih protonov v stranskih verigah. Ko identificiramo
spinske sisteme posameznih aminokislin, jih poskušamo povezati med seboj z uporabo 2D
NOESY NMR spektrov. Kot sedaj že vemo, NOESY eksperimenti omogočajo interakcijo protonov
preko prostora in zato bomo v spektru opazili signale za protone, ki so prostorsko blizu skupaj,
ne glede na to, ali so del istega spinskega sistema ali ne. S kombinacijo obeh pristopov lahko za
manjše proteine (nekje do velikosti 10 kDa), ob poznavanju primarne sekvence, asigniramo
vsak signal posamezni aminokislini. Pri večjih proteinih pri homonuklearnih 2D NMR
eksperimentih opazimo močno prekrivanje signalov, saj imajo določeni protoni zelo podobne
ali pa celo identične kemijske premike in jih ne moremo ločiti. Z večanjem velikosti proteina ta
težava postaja le še bolj izrazita.
Pri večjih proteinih moramo zato protein obogatiti z drugimi magnetno aktivnimi jedri,
predvsem 15N in 13C, da lahko s pomočjo heteronuklearnih 2D in 3D NMR eskperimentov
asigniramo vse signale. Najprej navadno posnamemo »prstni odtis proteina« oz. 1H-15N HSQC
NMR spekter. Ta sorazmerno hiter heteronuklearni NMR eksperiment pomaga pri odločitvi, ali
izvedemo nadaljnje zahtevnejše večdimenzionalne heteronuklearne NMR eksperimente. Prav
tako podatke iz spektra uporabimo za lažjo asignacijo amidnih protonov in protonov stranske
verige proteina, ki so vezani na dušik, saj oboji dajejo signal pri tem eksperimentu. Nadalje se
lahko poslužimo še 15N NOESY-HSQC in 15N TOCSY-HSQC različice NMR eksperimentov, ki
podajo še natančnejše informacije tako skapljanja protona z jedrom 15N preko vezi kot tudi
preko prostora.
Če je protein označen še z jedrom 13C, izvedemo še različne trojne resonančne NMR
eksperimente, ki nam pokažejo, kako se prenaša magnetizacija preko amidne (oz. peptidne
vezi) v proteinih. Dobimo več 3D NMR spektrov, ki nam omogočajo, da signale ločimo in tako
lažje pripišemo posamezni signal specifičnemu magnetnemu jedru.
D) ZBIRANJE KONFORMACIJSKIH OMEJITEV
Ko imamo enkrat vse NMR signale asignirane k posameznim magnetno aktivnim jedrom
preiskovanega proteina, nas zanimajo prostorske omejitve med njimi. Glavna parametra, ki jih
potrebujemo, sta omejitvi razdalj (ang. distance restrains) in omejitve kotov (ang. angle
restrains) med njimi. Ti podatki nam bodo v pomoč pri izračunu končne 3D konformacije
proteina.
Največ prostorskih omejitev dobimo iz 2D NOESY eksperimentov. Dobljeni NOESY signal med
dvema jedroma nakazuje, da sta le-ti prostorsko blizu skupaj. Navadno je ta razdalja v intervalu
med 1.8 in 6 Å, kjer lahko opazimo NOE. Intenzivnost posameznega NOESY signala je
sorazmerna z 1/r-6 razdalje med jedroma, in tako, glede na intenziteto vrha, lahko ocenimo
razdaljo med jedroma. Razmerje med intenziteto in razdaljo s to zvezo je le približno, zato
običajno določimo interval razdalje za vsako indetificirano interakcijo med jedri. Proces
identifikacije in ocene razdalj je navadno časovno zelo zahteven in pri tem uporabljamo več
računalniških programov, kot so PASD, XPLOR-NIH, UNIO, CYANA, ARIA in drugi. Uporaba 15N
in 13N NOESY NMR eksperimentov še poveča kvaliteto pridobljenih podatkov, saj omogoča
boljšo ločitev in asignacijo dobljenih signalov.
71
